Botulismi diagnoos põhineb Clostridium botulinum toksiini identifitseerimisel laboris ja kliiniliste sümptomite jälgimisel, isegi kui need on mõnikord mittespetsiifilised. Tegelikult võib haigust segi ajada Guillain-Barré sündroomiga, poliomüeliidiga, insultiga, myasthenia gravis'ega ja puukide paralüüsiga.
Toidu botulismi puhul on olulised vihjed neuromuskulaarsete häirete ja potentsiaalselt saastunud toidu allaneelamisel. Samaaegne ilming vähemalt kahel patsiendil, kes sõid sama toitu, lihtsustab diagnoosi. Kinnitus saadakse mikroorganismi isoleerimise teel patsiendi kahtlaste toiduproovide või väljaheidete kultuuritestiga ning botuliinitoksiini identifitseerimisega toidus või bioloogilistes materjalides (nagu veri, maomahl ja oksendamine).
Haava botulismi puhul kinnitavad seda seerumi toksiini diagnoos või Clostridium botulinum'i isoleerimine nahakahjustuse proovist.
